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質粒提取試劑盒簡介

更新時間:2010-01-11  |  點擊率:15536

質粒提取試劑盒簡介:
質粒(Plasmid)是一種染色體外的穩定遺傳因子,大小從1-200kb不
等,為雙鏈、閉環的DNA分子,并以超螺旋狀態存在于宿主細胞
中。質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中,它具有自主復制
和轉錄能力,能在子代細胞中保持恒定的拷貝數,并表達所攜帶的
遺傳信息。
質粒提取原理及流程:
較常用的質粒DNA提取方法有3種:堿裂解法、煮沸法和去污劑
(如Triton和SDS)裂解法。前兩種方法比較劇烈,適用于較小的質粒
(<15kb)。去污劑裂解法則比較溫和,一般用于分離大質粒(>15kb)。
堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質粒DNA的方法,其原理
為:染色體DNA比質粒DNA分子大得多,且染色體DNA為線狀分
子,而質粒DNA為共價閉合環狀分子;當用堿處理DNA溶液時,
線狀染色體DNA容易發生變性,共價閉環的質粒DNA在回到中性
時即恢復其天然構象;變性染色體DNA片段與變性蛋白質和細胞
碎片結合形成沉淀,而復性的超螺旋質粒DNA分子則以溶解狀態
存在液相中,離心去除沉淀后,就可從上清中回收質粒DNA。
目前,市面上質粒提取試劑盒大多數都是采取上述的堿裂解方法,
不同之處在于純化方式。目前比較常用的純化系統是硅基質吸附材
料,其原理為在高鹽環境下質粒DNA能夠結合到硅基質上,然后用
低鹽緩沖液或水將質粒DNA從硅基質上洗脫下來。得到的質粒可以
用于酶切、PCR、測序、細菌轉化、轉染等分子生物學實驗。
影響質粒提取的因素:
質粒提取的得率和質量與很多因素有關,如宿主菌的種類和培養
條件、細胞的裂解、質粒拷貝數、質粒的穩定性、抗生素、吸附
柱的吸附量等。
宿主菌種類
質粒主要存在于細菌、放線菌和真菌細胞中,多數情況下我們是
從大腸桿菌中提取質粒。大腸桿菌的菌株不同會影響質粒提取的
質量。從宿主菌如DH5α和*0中可以得到高質量的質粒DNA。
HBl01和它的衍生菌株,如TG1和JM系列會在裂解時產生大量的糖
類,如果沒有*去除,將抑制后續實驗中的酶活性,影響質粒
DNA提取的質量。另外,有些菌株有非常高的內切酶活性,會降低
DNA的得率。因此推薦使用DH5α和*0來提取質粒DNA。
培養時間
從固體培養基平板上挑取一個單菌落,接種到培養物中(含有相關抗生
素的液體培養基中),振蕩培養12-16小時。不應超過16小時,因為這時
細胞開始裂解,使得質粒的得率降低,也會導致質粒丟失或質粒變異。
質粒擴增
氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質和DNA的合成,但對松弛型質粒的
復制沒有影響。因此,在細菌培養液中加入氯霉素可提高松弛型質
粒的拷貝數。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質和DNA的合成,
從而抑制了染色體的復制,但質粒復制所用的酶半衰期較長,故質
粒仍可繼續復制,這樣既可增加質粒產量,又可降低細胞的數量,
使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。常用于擴增的氯霉素濃度為
170ug/ml 。
抗生素
在菌株的各生長階段都應加入抗生素篩選。現在用的許多質粒都不
含有在細胞分裂時確保平均分配的par位點,無質粒的子細胞在無
抗生素時復制速度遠大于含質粒的細胞。

質粒拷貝數:
質粒拷貝數常用的定義是指生長在標準的培養基下每個細菌細胞中
所含有的質粒DNA分子的數目。每個細胞中的質粒數主要決定于質
粒本身的起始復制機制。按照復制性質,可以把質粒分為兩類:一
類是嚴緊型質粒,當細胞染色體復制一次時,質粒也復制一次,每
個細胞內只有1-2個質粒,如F因子;另一類是松弛型質粒,當染
色體復制停止后仍然能繼續復制,每一個細胞內一般有20個左右質
粒,如ColEl質粒。一般分子量較大的質粒屬嚴緊型,分子量較小的
質粒屬松弛型。質粒的復制有時和它們的宿主細胞有關,某些質粒
在大腸桿菌內的復制屬嚴緊型,而在變形桿菌內則屬松弛型。
部分質粒的拷貝數
質粒種類 拷貝數 起始復制子 類型
pUC18/19載體 500-700 pMB1 高拷貝
pBluescript載體 300-500 ColE1 高拷貝
pGEM-T載體 300-400 pMB1 高拷貝
pTZ載體 >1000 pMB1 高拷貝
pBR322載體 15-20 pMB1 低拷貝
pACYC及其衍生載體 10-122 p1 低拷貝
pSC101及其衍生載體 5 pSC101 低拷貝
菌液收集及裂解
細菌收集可以通過離心來進行,不同的質粒拷貝數,菌液量的需
求不同,對于低拷貝的質粒,要相應增加菌液的量。菌液是在堿
性環境下裂解的,由于不同的宿主菌細胞壁厚薄的差異,細胞的
破壁程度不同,對于細胞壁較厚的宿主菌,首先要進行破壁處理:
革蘭氏陰性菌——不用特殊處理,堿裂解時就能有效破壁
革蘭氏陽性菌——溶菌酶處理
酵母和絲狀真菌——酵母破壁酶或玻璃珠
菌液收集、重懸以及宿主菌細胞破壁后,細胞在含有RNase A的
NaOH/SDS(溶液Ⅱ)中裂解。SDS溶解細胞膜的磷脂和蛋白成分,使
細胞的內容物如染色體、質粒DNA和蛋白在堿性環境下變性。佳的
裂解時間是質粒大量釋放而沒有釋放染色體DNA的時間,盡量縮短
質粒暴露在變性環境中。長時間處在堿性環境中會導致質粒發生不可
恢復的變性。變性的質粒在瓊脂糖膠上跑的較快,而且不能被限制性
內切酶消化。裂解產物在溶液Ⅲ中被調整到中性高鹽環境,高鹽使得
變性的蛋白、染色體DNA、細胞碎片和SDS都沉淀下來,而質粒復性
留在上清溶液中。溶液要*混勻以確保沉淀*。為了防止染色體
DNA污染質粒DNA,要避免劇烈振蕩,以防止染色體DNA被打斷,造
成對質粒DNA的污染。因為染色體DNA的片段和質粒DNA在高鹽條件
下,都可以與硅膠膜結合,在低鹽的條件下,用洗脫液都能從膜上洗
脫下來。因此,在裂解過程中要緩慢、輕柔顛倒離心管。
質粒DNA分離和純化:
純化要求
質粒DNA中不應存在對后續實驗中的酶活性有抑制作用的有機溶
劑分子或過高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質、多
糖、脂類、基因組和RNA的污染。不同的后續實驗對于質粒純度的
要求不同,常規的分子生物學實驗(如酶切、測序等)普通純度的質粒
即可滿足實驗,而對于轉染實驗,要求質粒的純度較高(如高純度或無
內毒素)。可以選擇不同的質粒提取試劑盒以滿足不同的實驗要求。
純化方法
用硅基質材料吸附質粒DNA來代替乙醇沉淀的純化方式,提取的質
粒純度高、操作方便快捷,可選擇的試劑盒有兩種類型,即普通質
粒提取試劑盒和無內毒素質粒提取試劑盒。
質粒DNA的洗脫和收集
質粒的保存
溶解在洗脫液TE中的質粒DNA,也可以貯存在TE緩沖液中(用水溶
解的質粒只能短期保存,因為實驗室用的純水呈弱酸性,質粒在
酸性環境下會發生磷酸解),4℃短期保存或-20℃和-70℃長期保
存,也可在含有質粒的細菌培養物中,加等體積甘油,于-70℃保
存 。
質粒鑒定與評價:
瓊脂糖電泳檢測
堿裂解法提取的質粒經瓊脂糖電泳進行鑒定時,理想狀況是只出現
超螺旋—條帶,但在質粒提取過程中,由于機械力、酸堿度、試劑
等原因,使質粒DNA鏈發生斷裂,可能出現兩條帶或者出現三條
帶,這三條帶電泳遷移率從快到慢,分別是超螺旋、開環和復制中
間體(即沒有復制*的兩個質粒粘連在—起)。如果加溶液Ⅱ后過
度振蕩,會在遠離這三條帶的位置出現條帶,這條帶泳動得較慢,
是大腸桿菌基因組DNA的片斷。非常偶然的是,有時候提取的質粒
會出現4個以上的條帶,這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度
的超螺旋(超螺旋的圈數不同)所致。但是,只要質粒經單酶切鑒定
后,只有單一條帶,就證明沒有基因組的污染。
酶切檢測
質粒提取后,為了進—步鑒定質粒的正確與否,就要進行酶切鑒
定,通過與Marker對比,確定質粒的分子量大小。
用紫外線分光光度計檢測
濃度測定標準為:OD260值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD260/
OD280比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD260/OD280比值
若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD260/OD280比值若高于2.0則說明
DNA有可能已降解。如果洗脫時不使用洗脫緩沖液,而使用去離子
水,比值會偏低,因為pH值和離子濃度會影響光吸收值,但并不表
示純度低。




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