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基因診斷的概念、常用技術與應用

更新時間:2017-04-06  |  點擊率:3061

基因診斷的概念  
一、基本概念:  
1.人類的絕大多數疾病都與基因有關,基因變異引起疾病兩種類型:  
1) 內源基因變異:由于先天遺傳和后天內外環境因素的影響,人類的基因結構及表達的各個環節都可發生異常,從而導致疾病。分基因結構突變和表達異常。  
2) 外源基因的入侵:各種病原體感染人體后,其特異的基因被帶入人體并在體內增殖引起各種疾病。基因改變引起各種表型改變,從而引起疾病,從基因水平探測分析病因和疾病的發病機制,并采用針對性的手段矯正疾病是近年基礎和臨床的方向。  
2.基因診斷:利用現代生物學和分子遺傳學的技術方法,直接檢測基因結構及表達水平是否正常,從而對疾病作出診斷的方法。  
二、基因診斷的特點:  
1.以基因做檢查材料和檢查目標針對性強;  
2.分子雜交選用特定基因序列作探針,故特異性強;  
3.分子雜交和PCR具有放大效應,故有較大的靈敏度;  
4.適用性強,診斷范圍廣。  

基因診斷的常用技術   
一、核酸分子雜交:  
核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統方法。其原理是核酸變性和復性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開,而在條件恢復后又可依堿基配對規律形成雙鏈結構。雜交通常在一支持膜上進行,因此又稱為核酸印跡雜交。根據檢測樣品的不同又被分為DNA印跡雜交(Southern blot hybridization )和RNA印跡雜交(Northern blot hybridization)。  
(一)核酸分子雜交的基本過程:  
①.DNA或RNA的制備:將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。  
②.制備探針;  
③.雜交;  
④.檢測。  
1.DNA或RNA的制備:將待測樣品用一定方法提取DNA或RNA。  
2.基因探針的概念:  
① 基因探針(probe)就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列,它可以包括整個基因,也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉錄而來的RNA。  
② 探針的來源:  
DNA探針根據其來源有3種:一種來自基因組中有關的基因本身,稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA,再通過逆轉錄得到的探針,稱為cDNA探針(cDNA probe)。與基因組探針不同的是,cDNA探針不含有內含子序列。此外,還可在體外人工合成堿基數不多的與基因序列互補的DNA的片段,稱為寡核苷酸探針。  
③ 探針的制備:  
進行分子突變需要大量的探針拷貝,后者一般是通過分子克隆(molecular cloning)獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品。當制備基因組DNA探針進,應先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不*水解,得到許多大小不等的隨機片段,將這些片段體外重組到運載體(噬菌體、質粒等)中去,再將后者轉染適當的宿主細胞如大腸桿菌,這時在固體培養基上可以得到許多攜帶有不同DNA的片段的克隆噬菌斑,通過原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過細胞擴增,制備出大量的探針。  
為了制備cDNA 探針,首先需分離純化相應mRNA,這從含有大量mRNA的組織、細胞中比較容易做到,如從造血細胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后,在逆轉錄酶的作用下,就可以合成與之互補的DNA(即cDNA),cDNA與待測基因的編碼區有*相同的堿基順序,但內含子已在加工過程中切除。  
寡核苷酸探針是人工合成的,與已知基因DNA互補的,長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質的氨基酸順序量,也可以按氨基酸的密碼推導出核苷酸序列,并用化學方法合成。  
④ 探針的標記:  
  為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交,有必要對探針加以標記,以便在結合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體,熒光素等作為標記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。常用的探針標記法是缺口平移法(nick translation)。




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